“Producción de calibradores recombinantes quiméricos para ensayos serológicos COVID-19”
Estudiante: Bach. Belén Márquez
Director de Tesina: Dr. Gabriel Lassabe
Los ensayos serológicos son un tipo de inmunoensayo con los que se detectan anticuerpos en suero, ya sea para el diagnóstico de una infección reciente, detección de alergias o evaluación de la calidad de la respuesta inmune humoral a largo plazo, entre otras cosas. Los inmunoensayos requieren calibradores y controles para poder distinguir resultados positivos y negativos, así como para la cuantificación. Los calibradores para ensayos serológicos suelen ser sueros que portan anticuerpos contra el antígeno de interés, lo cual acarrea desventajas: debido a su naturaleza policlonal no pueden ser completamente caracterizados, su reproducibilidad no es óptima y, al ser finitos, es necesario buscar nuevos sueros positivos a ser validados, aumentando el tiempo y costo de los ensayos. Una alternativa es la producción in vitro de calibradores recombinantes que mimeticen a la clase de anticuerpos a detectar, lo que resuelve las dificultades anteriores ya que éstos pueden producirse en forma eficiente e ilimitada, obtenerse en alta pureza (lo cual mejora la reproducibilidad de los ensayos), ser completamente caracterizados y almacenarse en condiciones que optimicen su estabilidad.
Este proyecto se centró en producir dos calibradores recombinantes quiméricos para ensayos de serología de SARS-CoV-2, constituidos por un nanobody fusionado a la región Fc de IgG1 humana. Se llama nanobody (Nb) a la forma recombinante del dominio VHH (variable) de anticuerpos de cadena pesada (HcAbs, Heavy-chain-only Antibodies), producidos por camélidos. Los Nbs presentan gran estabilidad conformacional y solubilidad, lo que permite su expresión recombinante en ausencia del resto de la cadena pesada o fusionados a otros dominios proteicos. A partir de Nbs previamente seleccionados contra antígenos de SARS-CoV-2 se construyeron vectores de expresión para dos calibradores Nb-Fc, uno de ellos reactivo contra la proteína de nucleocápside, y el restante reactivo contra el dominio de unión al receptor de la proteína Spike.
Los calibradores fueron expresados en células HEK293-T y purificados por cromatografía de afinidad. Se los caracterizó de forma general mediante técnicas como espectrometría de masas, gel-filtración (determinación de peso molecular), ELISA (evaluación de funcionalidad y estabilidad) e interferometría de biocapa (obtención de parámetros cinéticos y termodinámicos indicativos de afinidad).
Finalmente, los calibradores fueron incorporados a ensayos serológicos para la detección cualitativa de IgG anti-N y cuantificación de IgG anti-RBD. Para el primer caso, se logró un 82.5% de sensibilidad y 100% de especificidad, las curvas de calibración fueron reproducibles y permitieron normalizar ensayos donde se evaluó un número alto de sueros. Para el ensayo de cuantificación de IgG anti-RBD, se logró validar al calibrador recombinante al establecer una correlación entre la cuantificación con el mismo y con un estándar internacional, con la ventaja adicional de reducir el error relativo al lograr obtener curvas de calibración lineales. En suma, ambos calibradores Nb-Fc demostraron ser una alternativa robusta al uso de sueros para la estandarización de inmunoensayos.